Modelagem farmacocinética/farmacodinâmica do florfenicol para o tratamento da adenite equina por meio da simulação de Monte Carlo / Pharmacokinetic/pharmacodynamic modeling of florfenicol for the treatment of equine adenitis using Monte Carlo simulation

O objetivo deste trabalho foi avaliar a eficácia do florfenicol na dose usualmente empregada em equinos de 22 mg/kg pelas vias intravenosa, intramuscular e oral para o tratamento de adenite equina por Streptococcus equi. subsp. equi, usando a modelagem farmacocinética/farmacodinâmica (PK/PD – Pharmacokinetic/Pharmacodynamic) e a simulação de Monte Carlo. Foi realizada uma simulação de Monte Carlo a partir dos parâmetros PK, logo depois, efetuou-se a modelagem PK/PD para determinar as taxas de eficácia do antimicrobiano para o tratamento dessa infecção bacteriana, de acordo com o valor da concentração inibitória mínima (CIM), em um intervalo de CIM de 0,125 – 4 μg/mL. Pela via intravenosa, a probabilidade de erradicação bacteriana foi de 100% para CIM até 0,5 μg/mL e efeito bacteriostático com probabilidades de 99% e 80% para CIMs de 2 e 4 μg/mL, respectivamente. Já pelas vias intramuscular e oral a probabilidade de se atingir o índice de erradicação bacteriológica foi de 100% para CIM de até 0,5 μg/mL, contudo, atinge valores de 80% e 81%, respectivamente, para CIM de 1 μg/mL considerando o efeito bactericida (p<0,01). Portanto, através desse estudo é evidenciado a eficácia do florfenicol até a CIM de 0,5 μg/mL para as três vias de administração citadas, entretanto, para CIMs superiores a esse valor, é imprescindível o ajuste da dose farmacológica, evitando falhas na terapêutica e possível resistência microbiana.

The objective of this study was to evaluate the efficacy of florfenicol at the dose usually used in horses of 22 mg/kg by intravenous, intramuscular and oral routes for the treatment of equine adenitis caused by Streptococcus equi. subsp. equi, using Pharmacokinetic/Pharmacodynamic (PK/PD) modeling and Monte Carlo simulation. A Monte Carlo simulation was performed from the PK parameters, then PK/PD modeling was performed to determine the antimicrobial efficacy rates for the treatment of this bacterial infection, according to the minimum inhibitory concentration (MIC) value, in a MIC range of 0.125 - 4 μg/mL. Intravenously, the probability of bacterial eradication was 100% for MICs up to 0.5 μg/mL, and the bacteriostatic effect was 99% and 80% for MICs of 2 and 4 μg/mL, respectively. However, for the intramuscular and oral routes, the probability of reaching the bacteriologic eradication index was 100% for MICs of up to 0.5 μg/mL, however, it reaches values of 80% and 81%, respectively, for MICs of 1 μg/mL considering the bactericidal effect (p<0.01). Therefore, through this study the efficacy of florfenicol is evidenced up to the MIC of 0.5 μg/mL for the three routes of administration cited, however, for MICs higher than this value, it is essential to adjust the pharmacological dose, avoiding failures in therapy and possible microbial resistance.

Modelagem farmacocinética/farmacodinâmica do florfenicol para o tratamento da adenite equina por meio da simulação de Monte Carlo / Pharmacokinetic/pharmacodynamic modeling of florfenicol for the treatment of equine adenitis using Monte Carlo simulation

O objetivo deste trabalho foi avaliar a eficácia do florfenicol na dose usualmente empregada em equinos de 22 mg/kg pelas vias intravenosa, intramuscular e oral para o tratamento de adenite equina por Streptococcus equi. subsp. equi, usando a modelagem farmacocinética/farmacodinâmica (PK/PD ­ Pharmacokinetic/Pharmacodynamic) e a simulação de Monte Carlo. Foi realizada uma simulação de Monte Carlo a partir dos parâmetros PK, logo depois, efetuou-se a modelagem PK/PD para determinar as taxas de eficácia do antimicrobiano para o tratamento dessa infecção bacteriana, de acordo com o valor da concentração inibitória mínima (CIM), em um intervalo de CIM de 0,125 ­ 4 µg/mL. Pela via intravenosa, a probabilidade de erradicação bacteriana foi de 100% para CIM até 0,5 µg/mL e efeito bacteriostático com probabilidades de 99% e 80% para CIMs de 2 e 4 µg/mL, respectivamente. Já pelas vias intramuscular e oral a probabilidade de se atingir o índice de erradicação bacteriológica foi de 100% para CIM de até 0,5 µg/mL, contudo, atinge valores de 80% e 81%, respectivamente, para CIM de 1 µg/mL considerando o efeito bactericida (p<0,01). Portanto, através desse estudo é evidenciado a eficácia do florfenicol até a CIM de 0,5 µg/mL para as três vias de administração citadas, entretanto, para CIMs superiores a esse valor, é imprescindível o ajuste da dose farmacológica, evitando falhas na terapêutica e possível resistência microbiana.

The objective of this study was to evaluate the efficacy of florfenicol at the dose usually used in horses of 22 mg/kg by intravenous, intramuscular and oral routes for the treatment of equine adenitis caused by Streptococcus equi. subsp. equi, using Pharmacokinetic/Pharmacodynamic (PK/PD) modeling and Monte Carlo simulation. A Monte Carlo simulation was performed from the PK parameters, then PK/PD modeling was performed to determine the antimicrobial efficacy rates for the treatment of this bacterial infection, according to the minimum inhibitory concentration (MIC) value, in a MIC range of 0.125 - 4 µg/mL. Intravenously, the probability of bacterial eradication was 100% for MICs up to 0.5 µg/mL, and the bacteriostatic effect was 99% and 80% for MICs of 2 and 4 µg/mL, respectively. However, for the intramuscular and oral routes, the probability of reaching the bacteriologic eradication index was 100% for MICs of up to 0.5 µg/mL, however, it reaches values of 80% and 81%, respectively, for MICs of 1 µg/mL considering the bactericidal effect (p<0.01). Therefore, through this study the efficacy of florfenicol is evidenced up to the MIC of 0.5 µg/mL for the three routes of administration cited, however, for MICs higher than this value, it is essential to adjust the pharmacological dose, avoiding failures in therapy and possible microbial resistance.

Immunogenicity of Streptococcus equi subsp. equi recombinant SeM protein and bacterin in mice

ABSTRACT: The infection caused by Streptococcus equi, known as strangles, affects the respiratory system of horses, causing high morbidity and rapid spread among the herd. Bacterin vaccines, composed of inactivated whole cells of S. equi, have variable efficacy and duration. Infected animals produce specific antibodies against SeM, the immunodominant antigen of S. equi. This makes it a promising target for vaccine development. In this context, the objective of this work was to evaluate a vaccine combining S. equi bacterin and recombinant SeM protein. Mice were vaccinated with bacterin (S. equi ~1.2 × 108CFU/ml); rSeM protein (20g); bacterin-rSeM combination; or PBS (Control Group) and challenged with a suspension of S. equi, containing 10 × LD50. All vaccinated mice survived the challenge and produced anti-rSeM and anti-S. equi antibodies, which were assessed by indirect ELISA. The Control Group reached endpoint criteria 96 h after infection. These results demonstrate that a vaccine combining the S. equi bacterin with rSeM protein protects mice against strangles. This combination vaccine could potentially protect horses and overcome the limitations of currently available strangle vaccines.

RESUMO: A infecção causada por Streptococcus equi, denominada adenite, atinge o sistema respiratório de equinos, causando alta morbidade e rápida disseminação entre o rebanho. Vacinas bacterinas, compostas de células inteiras inativadas de S. equi apresentam eficácia e duração variáveis. Animais infectados apresentam anticorpos específicos à proteína SeM, antígeno imunodominante de S. equi, o que a torna um alvo promissor para o desenvolvimento de vacinas. Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi avaliar uma vacina baseada na administração simultânea da bacterina e da proteína SeM recombinante. Camundongos foram vacinados com a bacterina (S. equi ~1.2 × 108CFU/ml); a proteína rSeM (20g); a bacterina e rSeM simultaneamente; ou PBS (Grupo Controle) e, posteriormente, foram desafiados com uma suspensão de S. equi contendo 10 × LD50. Todos os animais vacinados apresentaram anticorpos anti-rSeM e contra S. equi, avaliados através de ELISA indireto, e mantiveram-se e sobreviveram ao desafio letal. O Grupo Controle atingiu critérios de endpoint 96 h após a infecção. Estes resultados demonstram que uma vacina constituída de células inteiras de S. equi com rSeM protege camundongos contra adenite, sugerindo a capacidade de proteção a equinos e, possivelmente, superando as limitações das vacinas contra adenite atualmente disponíveis.

Immunogenicity of Streptococcus equi subsp. equi recombinant SeM protein and bacterin in mice / Imunogenicidade da proteína recombinante SeM de Streptococcus equi subsp. equi e da bacterina em camundongos

The infection caused by Streptococcus equi, known as strangles, affects the respiratory system of horses, causing high morbidity and rapid spread among the herd. Bacterin vaccines, composed of inactivated whole cells of S. equi, have variable efficacy and duration. Infected animals produce specific antibodies against SeM, the immunodominant antigen of S. equi. This makes it a promising target for vaccine development. In this context, the objective of this work was to evaluate a vaccine combining S. equi bacterin and recombinant SeM protein. Mice were vaccinated with bacterin (S. equi ~1.2 × 108CFU/ml); rSeM protein (20μg); bacterin-rSeM combination; or PBS (Control Group) and challenged with a suspension of S. equi, containing 10 × LD50. All vaccinated mice survived the challenge and produced anti-rSeM and anti-S. equi antibodies, which were assessed by indirect ELISA. The Control Group reached endpoint criteria 96 h after infection. These results demonstrate that a vaccine combining the S. equi bacterin with rSeM protein protects mice against strangles. This combination vaccine could potentially protect horses and overcome the limitations of currently available strangle vaccines.(AU)

A infecção causada por Streptococcus equi, denominada adenite, atinge o sistema respiratório de equinos, causando alta morbidade e rápida disseminação entre o rebanho. Vacinas bacterinas, compostas de células inteiras inativadas de S. equi apresentam eficácia e duração variáveis. Animais infectados apresentam anticorpos específicos à proteína SeM, antígeno imunodominante de S. equi, o que a torna um alvo promissor para o desenvolvimento de vacinas. Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi avaliar uma vacina baseada na administração simultânea da bacterina e da proteína SeM recombinante. Camundongos foram vacinados com a bacterina (S. equi ~1.2 × 108CFU/ml); a proteína rSeM (20μg); a bacterina e rSeM simultaneamente; ou PBS (Grupo Controle) e, posteriormente, foram desafiados com uma suspensão de S. equi contendo 10 × LD50. Todos os animais vacinados apresentaram anticorpos anti-rSeM e contra S. equi, avaliados através de ELISA indireto, e mantiveram-se e sobreviveram ao desafio letal. O Grupo Controle atingiu critérios de endpoint 96 h após a infecção. Estes resultados demonstram que uma vacina constituída de células inteiras de S. equi com rSeM protege camundongos contra adenite, sugerindo a capacidade de proteção a equinos e, possivelmente, superando as limitações das vacinas contra adenite atualmente disponíveis.(AU)

"Cell ELISA" como ferramenta auxiliar no controle da adenite equina / "Cell ELISA" as an auxiliary tool for the control of equine adenitis

Este trabalho relata o desenvolvimento e a avaliação de um ensaio imunoenzimático (ELISA) como ferramenta auxiliar no controle da adenite equina. Foi avaliada a presença de anticorpos anti-Streptococcus equi subsp. equi em equinos com doença clínica de garrotilho, portadores assintomáticos e potros vacinados. Equinos doentes demonstraram absorbâncias médias superiores (P<0,05) às médias observadas nas demais categorias examinadas. Equinos portadores assintomáticos apresentaram valores médios de absorbância superiores (P<0,05) aos animais com cultura negativa. Logo após a vacinação, potros apresentaram elevação nos níveis de anticorpos, seguida de um decréscimo nos níveis 90 dias após a segunda vacinação. O "Cell ELISA" foi eficiente para a detecção de anticorpos em equinos expostos a antígenos de S. equi, diferenciando-se de infecções por S. zooepidemicus. O "Cell ELISA" mostrou-se uma alternativa clínica para o diagnóstico indireto da adenite equina, diferenciando-se, entre equinos assintomáticos, os potenciais portadores da infecção. Os resultados observados em potros vacinados confirmam o potencial de utilização desse teste como ferramenta em programas de vacinação contra garrotilho pelo monitoramento de rebanhos pós-vacinação. Esses resultados sugerem que o "Cell ELISA" é uma promissora ferramenta auxiliar no controle da adenite equina.(AU)

This study reports the development and evaluation of the use of "Cell ELISA" as a tool for clinical interpretation for the control of strangles. The presence of anti-S. equi antibodies was evaluated in horses with strangles, in asymptomatic carriers and in vaccinated foals. Equine positive for strangle showed higher average of absorbance (P<0.05) when compared with the average for the other categories of horses studied. Asymptomatic S. equi equine carriers had higher average of absorbance (P<0.05) than equines with negative culture. After vaccination, foals presented an increase in antibody levels, followed by a decrease in antibody levels 90 days post the second vaccination. The "Cell ELISA" was efficient for the detection of antibodies in horses exposed to S. equi antigens, differentiating infections with S. zooepidemicus. Thus, the test might be a clinical tool for indirect diagnosis of the strangles, differentiating, between the asymptomatic horses, the potential carriers of infection. The results observed in vaccinated foals confirm the potential use of this test as an auxiliary instrument for strangles vaccination programs based in the serological monitoring of the herd after immunization. These results suggest that the "Cell ELISA" is a promising auxiliary tool in the control of equine adenitis.(AU)

Imunogenicidade da proteína M recombinante de Streptococcus equi subsp. equi coadministrada com um adjuvante molecular / Immunogenicity of recombinant M protein of Streptococcus equi subsp. equi co administered with a molecular adjuvant

The strangles is an infectious disease that affects horses from all ages and causes important economic losses in the equine-related business. The aim of this work was to evaluate the immunogenicity of the recombinant M protein from Streptococcus equi (rSeM) co-administered with the recombinant heat-labile enterotoxin B subunit from Escherichia coli (rLTB) in mice and horses. A total of 72 female Balb-c mice were divided into eight groups and 18 horses were divided into six groups. The animals were inoculated by intramuscular (IM) or intranasal (IN) routes with different treatments of rSeM, rLTB and/or Al(OH)3. The results obtained in both species, independent of administration routes, demonstrated that rSeM + rLTB had higher levels of specific serum immunoglobulins, however, in mucosal immunity the increase was not identified. Thus, the use of rSeM as vaccine antigen and rLTB as adjuvant can be a potential tool in the control of equine strangles.(AU)

Primary bilateral guttural pouch empyema in a two-month-old foal / Empiema de bolsa gutural primário bilateral em potro de dois meses

The present report describes a 2-month-old foal which signs of respiratory infectious disease, bilateral retropharyngeal swelling and nasal mucopurulent discharge, suggesting guttural pouch empyema. The owners reported that the foal lived in a herd that experienced an outbreak of strangles. Foals younger than 3 months are usually protected against infectious diseases, however in this case, the foal was exposed to an environment heavily populated by Streptococcus equi equi during the outbreak of strangles. Although uncommon in such young animals, the foal was infected and developed a primary bilateral guttural pouch empyema, without signs of lymph nodes alteration.

O presente trabalho descreve o caso de um potro de dois meses de idade com sinais de infecção respiratória, distensão bilateral da região retrofaríngea e secreção nasal mucopurulenta, sugerindo empiema de bolsa gutural. Os proprietários relataram que o potro pertencia a uma tropa que havia sido acometida por garrotilho recentemente. Potros com menos de 3 meses de idade são normalmente protegidos contra as doenças infecciosas, no entanto, este potro foi exposto a um ambiente altamente contaminado por Streptococcus equi equi durante o surto de garrotilho. Embora incomum em animais tão jovens, o potro foi infectado e desenvolveu um empiema primário de bolsa gutural, não havendo sinais de acometimento dos linfonodos.

Perfil fenotípico e susceptibilidade antimicrobiana de Streptococcus equi isolados de equinos da região Sul do Brasil / Phenotypic profile and antimicrobial susceptibility of Streptococcus equi isolated from horses in southern Brazil

As características fenotípicas [morfológicas, bioquímicas, susceptibilidade aos antimicrobianos, índice de resistência múltipla aos antimicrobianos (IRMA), concentração inibitória mínima (CIM) e concentração bactericida mínima (CBM) da benzilpenicilina] de 38 isolados de Streptococcus equi oriundos de amostras clínicas de animais com adenite equina foram alvo deste estudo. A fenotipia demonstrou três padrões de colônias, três biotipos de fermentação de carboidratos e variação de 0 a 0,4 no IRMA. Todos os isolados de S. equi demonstraram sensibilidade à penicilina, tanto pelo método de disco difusão quanto pelo método de microdiluição. A CIM e CBM média de benzilpenicilina foi de 0,0095μg/mL e 0,0267μg/mL para S. equi subesp. equi e de 0,0128μg/mL e 0,0380μg/mL para S. equi subesp. zooepidemicus. Os valores de CIM e CBM diferiram entre as subespécies (p<0,05). O diâmetro do halo de inibição de penicilina demonstrou relação com a CIM (ì=0,03638 - 0,00072x) para S. equi subesp. equi. Também foi demonstrada relação entre o diâmetro do halo de inibição de penicilina com a CBM para S. equi subesp. equi (ì=0,10931- 0,00223x). Entretanto para as amostras de S. equi subesp. zooepidemicus esta relação somente foi verificada para a CBM (ì=0,1322 - 0,00271x). A CIM de benzilpenicilina frente às amostras isoladas da região Central, Planalto e Sul do estado do Rio Grande do Sul foram estatisticamente semelhantes, mas diferiram do isolado do estado do Paraná, sugerindo o caráter atípico desta cepa. Todos os isolados de S. equi são sensíveis à penicilina e sulfazotrim, confirmando a eleição destes antimicrobianos para o tratamento das infecções por este agente na clínica veterinária. Os resultados obtidos não dispensam a utilização prudente dos antimicrobianos.

Phenotypic characteristics [morphology, biochemical fermentation, antimicrobial susceptibility, index of multiple resistances to antimicrobials (IMRA), minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum bactericidal concentration (MBC) of benzilpenicillin] of 38 Streptococcus equi isolates from clinical samples of horses with strangles were the aim of this study. The phenotypic analyses demonstrated three colony patterns, three carbohydrate fermentation biotypes and IMRA variation from 0 to 0.4. All the isolates of S. equi demonstrated sensitivity to penicillin, both by the disc diffusion method and microdilution method. The average MIC and MBC for benzilpenincillin were of 0.0095μg/mL and 0.0267μg/mL for S. equi subsp. equi and of 0.0128μg/mL and 0.0380μg/mL for S. equi subsp. zooepidemicus. The values of MIC and MBC differed between the subspecies (p<0.05). The diameter of penicillin inhibition halo demonstrated a relation with the MIC (ì=0.03638 - 0.00072x) for Streptococcus equi subsp. equi. A relation between the diameter of the inhibition halo of penincillin was also observed with the MBC for S. equi subsp. equi (ì=0.10931 - 0.00223x). However for the samples of S. equi subsp. zooepidemicus this relation was only verified with the MBC (ì=0.1322 - 0.00271x). The MIC of benzilpenicillin of the samples isolated from the Central, Planalto and South regions of Rio Grande do Sul were statistically similar, although different from the Paraná state sample, suggesting the atypical character of this strain. All the S. equi isolates are sensitive to penicillin and sulfazotrim, confirming these as antibiotics of choice for the treatment of infections caused by this agent in the clinical veterinary practice. The results obtained do not discard the prudent use of antimicrobials.

Adenite equina: sua etiologia, diagnóstico e controle / Strangles: etiology, diagnosis and control

A adenite equina, também conhecida como garrotilho, é uma enfermidade bacteriana contagiosa, causada por Streptococcus equi, subsp. equi, bactéria β hemolítica do grupo C de Lancefield, que afeta o trato respiratório anterior de equinos de todas as idades, com maior prevalência entre um e cinco anos de idade. Caracteriza-se por produzir secreção mucopurulenta das vias aéreas anteriores e linfadenite dos gânglios retrofaríngeos e submandibulares com formação de abscessos. Fatores de virulência de S. equi, subsp. equi, incluem cápsula de ácido hialurônico, hialuronidase, estreptolisina O, estreptoquinase, receptores para Fc de IgG, peptidoglicano e proteína M. Dentre esses fatores, a proteína M tem especial importância por ser de membrana com propriedades antifagocitárias e de aderência. A doença tem baixa letalidade e alta morbidade e seus prejuízos econômicos devem-se à perda de performance e custo do tratamento. O diagnóstico clínico e o tratamento não apresentam dificuldades, mas a profilaxia é prejudicada pela baixa eficiência das vacinas disponíveis, com índices de proteção de 50 por cento. O garrotilho pode ocorrer em todas as épocas do ano, mas o frio e a umidade facilitam a sobrevivência do agente e sua disseminação, portanto animais que vivem nos estados mais frios e úmidos do país são mais vulneráveis à infecção. Novas vacinas utilizando antígenos purificados ou de subunidades estão sendo desenvolvidas com a finalidade de incrementar sua potência e evitar efeitos indesejáveis. A comprovação de diferenças de antigenicidade, entre estirpes, alerta sobre a importância da seleção apropriada das cepas vacinais.

Strangles is a contagious disease of the respiratory tract of horses produced by Streptococcus equi subsp. equi, a Lancefield's group C β haemolytic bacterium. It produces a mucopurulent secretion of the anterior airways, as well as lymphadenitis and abscesses. The bacteria synthesizes several pathogenicity factors such a hyaluronic acid capsule, hyaluronidase, streptolisin O, streptokinase, IgG Fc receptors, peptidoglican and protein M. Among these factors, protein M deserves special importance due to its antifagocitic and adherence properties. The disease has high morbidity and low lethality, and produces economic losses due to low performance and treatment. Clinical diagnosis and treatment are done easily, but prophylaxis is hampered by the low potency of vaccines, that protect around 50 percent of vaccinated animals. Strangles may occur during all the year, but cold and humid weather favors the survival of streptococci, making animals that live in regions with those characteristics more prone to infection. New vaccines using purified or subunit antigens have been developed aiming to increase their potency and to avoid undesirable side effects. The demonstration that bacteria strains show differences in their antigenicity, called attention on the selection of appropriate strains to use as antigens.